「ギガ甘タンパク質・ソーマチンを合成しよう」ネタももう大分長くなっていますが、前半部ともいえるDNAパートは割と細かい点まで結構見てきた感じで、思いの外色々な点に触れられたように思います。
続いては、「DNA→RNA→タンパク質」の後半部、実際に遺伝子からモノを作っていくパートですね。
まぁ、何事も話が進むほど複雑になっていくものなので、本当ならどんどんややこしくなっていく形なのですが、まま、これは入門編ですし、深入りしても今まで以上に面白くなくなるだけにしか思えないので、ごくごく簡単にまとめる程度、分量的には前半9後半1ぐらいになるよう、あっさりと終わらせるのでいいかな、と思っています。
とりあえず全体の流れを改めておさらいしておくと、こんな感じですね。
【大腸菌にタンパク質を作ってもらおう！】
1. 遺伝子DNAをゲットする！⇒済み！（遺伝子を注文しよう！）
2. そのDNAを、制限酵素とDNAリガーゼを使って、プラスミドに導入する（クローニング）！⇒済み！（図を見れば一発？！改めて、分かりやすくDNA切り貼りの仕組みを紹介！）
3. その遺伝子組込みプラスミドDNAを大腸菌にぶち込む（形質転換）！⇒済み！（たった数日で1000万円分のモノが作れる、楽しい作業）
4. DNAがぶち込まれた大腸菌の選別！⇒済み！（遺伝子をぶち込まれたやつだけが生き残れる、サバイバルゲーム！）
5. 選ばれた「DNAがぶち込まれた大腸菌」をひたすら増やそう！⇒済み！（DNAを増やそう）
6. タンパク質合成のスイッチON！←今ココ
7. 満を持して、目的タンパク質の収穫！
8. さすがにそのまんまでは大腸菌まみれで汚いので、キレイに精製しよう！
→見事、手元には大量の純品タンパク質が！やったね！！
微妙に細かくおさらいしておくと、まず、ソーマチン遺伝子を入れるプラスミドとしてpET-15bという名の「大腸菌でのタンパク質合成用途に特化したプラスミドDNA」を用いるという話でした。
クローニング後、ステップ3の大腸菌に導入する所で、必須ではないものの普通はやる工程として、ライゲーション産物を、まずはDNAクローニング用の大腸菌株（K株という分類がされる、DH5αなど）にぶち込んで、ミニプレでDNAを回収します。
これで手元には大量の純品プラスミドDNA（＝クローン）が存在することになるので、念のためシークエンシングで配列をチェックして、OKだったら改めてタンパク質合成用の大腸菌株（B株という分類の、BL21など）にぶち込ぶという形ですね。
この、pET-15bを導入したBL21株を使って、いざ、タンパク質を作っていこう！…という流れで今ステップ6に来ているといった所でした。
しかし、もう長いこと「遺伝子のスイッチをON」だか何だかよぉ分からんことを書いているわけですが、果たしてこいつは一体何なのか？！…ということには、今までほとんど触れていませんでした。
まぁ触れていなかったのには理由があって、そもそも分子生物学入門講座を唐突に始めていたわけですけど、アミノ酸に始まり、DNAの話をして、次はRNAの話に入ろう、と思っていた矢先にソーマチンの話に脱線していたため、どうも「RNAについてまともに触れていない状況で、その辺のスイッチどうたらの話をしていくのも無理があるなぁ…」と思ってるといいますか、「またその辺の話をしてからに…」ってな感じで先へ先へと先延ばしにしていた形だったのです。
とはいっても（さっきも書きましたが）そもそももうそのRNAの話自体が、正直DNAよりずっとややこしくなるので、入門編的にはもう深入りしない方がいい気がする（というか深入りしてもあんまり面白くない）かなぁ、って感じともいえるので、もうごくごく簡単に、高校生物の範囲で収まるぐらいの話でえぇんちゃうかな、なんて思ってる感じですね。
御託が長くなりましたが、そうはいってもやっぱりせっかくの機会ですし、まああまり細かすぎない範囲で、なるべく分かりやすさ優先で説明することを試みてみるとしましょう。
その遺伝子スイッチですが、これはもう、一言で「こういうの」とはいえないほど多種多様なものが存在しているとしかいえないわけですけど（そうじゃなければこんなに複雑で精緻な生体反応を見事にコントロールできるわけがない）、あえていえば、最も重要にして制御も容易な遺伝子スイッチ界（そんな界隈があるのかよ(笑)）の主役は、DNA→RNAという流れの、まさにここ！
ただの文字列情報であるDNAを、タンパク質合成の実行部隊といえるRNAに変換するためのスイッチであるといえましょう。
…って、やっぱりRNAについての説明をほぼ全くしていないのに、いきなり「DNA→RNA」とか「タンパク質合成の実行部隊」とかいわれてもよぉ分からんて……となってしまう気もするのですが、とりあえず今は、
「DNAは二本鎖で安定してるから保存に便利だけど、二本鎖が複雑に絡み合ってるからこそ、そのままでは使いづらい（ちょうど、分厚すぎるレシピ本のようなもの）。
実際にタンパク質を料理するためには、扱いにくい巨大なレシピ本の一部のページをコピーして、使いやすい形に変換してやる必要があるんだ！
その、『レシピ本のコピー』が、一本鎖で不安定だけど機動性もよく実働に便利な、RNAなのである！」
…と思っていただければそれでバッチリです。
まぁ例え話にすると、一見分かりやすいようで逆にはぐらかされてるような感じというか何というか、逆にちょっと分かりにくくなってるだけかもしれませんが、実際に生物はDNAの情報をそのままは使えず、まずRNAに変換する！…というステップを踏むのは絶対に必須となっているので、その方が便利だったのか都合がいい場面があったのかそんなこたぁ知りませんけど、マジで今この世に存在するあらゆる生物がその仕組みを採用していますから、これはもう「それはそうなってるんだ」と納得する他ない話ともいえるかもしれませんね。
ちなみにその「変換」については、例えばソーマチン遺伝子は開始コドンからATGGCC…という文字列の並びでしたが、この場合、DNAが5'-dAdTdGdGdCdC…-3'と3'-dTdAdCdCdGdG…-5'というものがぴったりくっついている二本鎖なわけですけど（小文字のdはDNAであることを分かりやすく明示しているだけ）、RNAはそのどちらか一方の鎖を使って（この場合は後者の鎖を鋳型に、前者と同じ文字列をコピー）、5'-AUGGCC…-3'というものが作られる、という形の変換ですね。
DNA二本鎖のどちらの鎖が読まれるかは、まさに今回見るスイッチによって決まっているという話です。
いい加減前置きから具体的な話へと進んでいくとしましょう。
ソーマチン実験で使う材料はこれまでに何度か具体的に見たことがありましたし、今回は改めてこいつらを使って説明するのが良さそうですね。
こちらの記事（実践！楽しいタンパク質の作り方講座・材料のチェック編）で貼ったことがあったというか、実はもうそこでもちょろっと言及もしていましたが、pET-15bの、お好みの遺伝子を導入する部分、いわゆるクローニング領域の拡大図（＝リング状のプラスミドDNAの、ごく一部の拡大図）を使わせていただきましょう。
実験序盤・クローニングのステップの解説では、「この、NdeIとBamHIという制限酵素で切れる部位に、ソーマチン遺伝子を挿入していきます」…などという点を見ていましたが、今回のポイントは、それより上流にある、T7 promoter！
このプロモーターと呼ばれるDNAの文字列こそが、まさに代表的な遺伝子スイッチなのです！！
とにかく似たような用語が大量に出てきてそれだけでやる気をなくすんですけど、まぁ用語は用語なので仕方ないとしてそのまま出しますと、さらに、このプロモーターを認識するT7 RNA polymerase（ポリメラーゼ。英語読みならポリメレース）と呼ばれるタンパク質が、実際にこのスイッチをONにするといいますか、この領域からDNAをRNAに変換していくんですね。
なので、ややこしいけれど改めて整理すると、プロモーターがモノとしてはDNAの領域のことで、まぁいわばここがスイッチそのものとして存在しており（いやでも下手に例え話をしても混乱するだけなので、スイッチうんぬんは無視してもいいかもしれませんが）、そして、ポリメラーゼがモノとしてはタンパク質分子のことで、こいつがスイッチを押す役目かつ実際にDNAを読みながらその文字列通りにRNAをつなげていく実行部隊、いわばRNA合成マッシーンとでもいうべき役者だということですね。
…あぁ、そういえば、シークエンシング反応でDNAを1塩基ずつ伸ばしていくやつで、DNAポリメラーゼという酵素を見ていましたね（参考：DNAの読み方をとても分かりやすく説明するよ）。
DNAポリメラーゼが、DNAの文字列を読んでその通りに新しいDNA鎖を合成していくやつでしたが、RNAポリメラーゼは、同じく鋳型となるDNAの文字列を読んで、その通りに新しいRNA鎖を合成していくやつだということなんですね。
そもそもポリマーというのは、1つの分子を連続でつなげた多量体という意味の言葉でしたから（参考：モノとポリ…いっぱいつながった、超お役立ちアイテム！）、そこに、酵素でよく使われる語尾である-aseをつなげて、polymeraseというのは「連結酵素・合成酵素」って意味合いがあるという感じです。
ちなみにT7プロモーターは、TAATACGACTCACTATA(G)というわずか17文字ぐらいの領域で、あまりにもよく使う配列ですから、僕なんかはもうソラでいえるぐらいですね（TAATA、CGA、CTCAC、TATAGGGみたいに、575ならぬ、5357のリズムで唱えることが多いですが、やっぱりTとAが特徴的な感じですね（ソラでいえるとかいって、真ん中の部分は時々詰まりますけど(笑)））
またちなみに最後のGは、カッコでくくった通りこれはT7プロモーターでは必ずしもないんですけど（pET-15bの図でも、TATAまでになってますね）、このGがRNA合成の一発目、つまり新しいRNA鎖の1番目の塩基になることが知られており、T7プロモーター自身は「…TATA」までなのですが、最初がGじゃないと合成効率（伸長効率）が著しく低くなるため、基本的にT7プロモーターを使う場合はここに必ずGを配置します。
さらにいうと、最初の3塩基がGGGとなると極めてRNA合成の効率が良いことも知られているので（最も効率が高いのかな？直接比較したことはありませんが、伝統的に、特にこだわりがないなら、T7で作るRNAはGGGで始めることが多いです）、まぁざっくりと、TATAからGGGまでをT7プロモーターと含めて考えることも多いですね。
なお、ちょうど上図T7プロモーターの矢印のすぐ上にT7 promoter primerというものも載っていました。
初めて学んだときは「プラスミド…プロモーター…ポリメラーゼ…プライマー…P系の、似た言葉多すぎぃ！」と誰もが発狂することになるややこしいやつなわけですが、これは単に、プライマー（DNA合成を始める取っ掛かりのための短いDNA鎖…この辺の記事前後で何度も触れていましたが、覚えてらっしゃる方は覚えているかもしれませんね）として、pET-15b開発元のNovagenが、「弊社ではT7 promoterを認識するプライマーを売っています。シークエンシングをしたいときなんかは、これが便利ですよ」ということを宣伝しているだけで（なので、カタログナンバーも併記されている感じですね）、遺伝子スイッチうんぬんに直接関係する要素ではない感じになります。
一方、話を戻すと、「そもそもT7って何だよ？」って話ですが、これは、僕は最初プロモーター配列のTの数が7個なのかな？とか思ってたんですけど、数えたら5個しかないし何やねんとなったものの、こいつは実はT7ファージという、これまたウイルスの一種（細菌に感染するウイルス＝ファージ）から発見されたものというだけで、起源はただのファージの名前だったってことですね。
T7ファージは例によって例のごとく、なかなかイカついナリをしてらっしゃいます。
じゃあT7のTは何だよ、って話にもなりますが、これは単に、大腸菌で発見されたファージを、順番にType 1からType 7まで名付けただけで、TypeのTってだけのようですね。
あとそれからT7 RNAポリメラーゼですが、これも名前しか出していなかったのでまずは形を見ておくとしましょう。
（ただのDNAの領域である）T7プロモーターはたったの17塩基でしたけど、このマシーンは883アミノ酸から成る結構巨大なタンパク質になります。
例によってこんなのを見ても何も分かりませんが、T7 RNAポリメラーゼがDNA（のプロモーター領域）を認識し、その後RNAを伸ばしている様子の模式図がこんな感じですね。
（…丸で何も分からない、全く何の意味もない図！しかし、せっかくなので、後で掲載する自作図で、せめて色だけは踏襲させていただくとしましょう。）
「いや『認識している』って、そのT7 RNAポリメラーゼとやらには目玉でもついてんのか？どうやって認識してんだよ？！」…と誰しもが思うし実際僕も昔はそう思ってましたが（今でもちょっと思ってますけど(笑)）、これは結局分子というのは熱運動で細胞の中をビュンビュン飛び回っており、たまたまT7 RNAポリメラーゼがT7プロモーターにくっつく（ぶつかる）こともある、そしてそのとき、ポリメラーゼはプロモーターに強く結合する性質をもっているので、一度出会ったらガッチリ結び付いて離れず、そのままRNA合成反応が進んでいく…という、結局それを聞いても「いや、たまたま出会ったものが『強く結合する』って、そんな都合いいことある！？」と思えるんですけど、これはもうマジで「あるんです」としかいえない話ですね。
実際に、この反応は（たった2分子が絡む単純すぎる反応ですし）別に細胞の中とかじゃなくても余裕で再構成できまして、チューブの中に、鋳型となるDNA（当然、T7プロモーター配列を含む）と、T7 RNAポリメラーゼと、あとはRNA合成の材料となるヌクレオチドNTPなんかを混ぜて放置しますと、マジで、冗談抜きに、ガンガンRNAが合成され、作るRNAの長さにもよりますが、多くの場合、RNAポリマーが超大量に合成されることで、反応液は最終的に白濁するぐらいにまでジャンジャン作られまくります。
ただ混ぜて放置するだけで、まるで機械が製品を作るかのごとく、チューブの中でポコポコ反応が進み続ける感じなんですね。
何度か書いてますけど、そんな都合いい話、ニワカには信じられねぇなぁ～、としか思えない感じなのは僕自身そう思うタイプなので本当に理解できるんですが、そんな都合いいことを実際にやってのけてるのが生物であり分子レベルの化学反応ってやつでして、これはもう騙されたと思って信じるしかないのが生物学といいますか、「実際疑り深い僕がこの手でやってみた、結果、マジで必ずちゃんと理論通り反応が起こってるんで、こればっかりはお願いだから信じてくれ！」としかいえない話かもしれませんね。
（素直に「そうなんだ」と信じることで理解が進むのが生命科学、ともいえるかもですね。）
なお、あまりにも細かいことですが、T7 RNAポリメラーゼはDNA認識に二本鎖DNAを要求するので、一本鎖DNAとポリメラーゼを混ぜても、反応は始まりません。
ただし、RNA合成（伸長）には二本鎖DNAを要求しないので、プロモーター部分、つまり、TAATACGACTCACTATAの部分だけは絶対に二本鎖でないといけないものの、そこから先、GGG…の部分は、こいつは一本鎖であっても問題ありません（ただし、当たり前ですが、合成されるRNAはGGG…の方なので、用意するのは相棒である逆向き鎖でなくてはなりません）。
もちろん「一本鎖であってもよい」であって、二本鎖であっても別に全く問題ないといいますか、むしろ普通は「どっちが鋳型で、どっちが合成される鎖かな？」とか考えなくていいので楽だしそもそも普通に用意したらDNAは二本鎖になるしで、基本的に全体が二本鎖になってるDNAを使いますが、場合によっては一本鎖DNAのみが手元にあるような場合もあって、そういうときは注意せねばいけないという感じですね。
（…言葉だけではあまりにも分かりにくいので、また適当な図で説明しておきましょう…。）
T7 RNAポリメラーゼは、T7プロモーター領域を認識して結合して、そこを起点にDNAの鋳型通りにRNAを合成していくわけですが…
プロモーター領域が一本鎖だと、ポリメラーゼはプロモーターに結合できず、反応を進められません！
ただし、プロモーター領域さえ二本鎖なら、あとは一本鎖でも問題なしです。
でももちろん、プロモーターがちゃんと二本鎖でも、鋳型として必要となる、一連の図でいう下の鎖が欠けていたら、当然これも仕組み的にRNAは合成されない、ってことですね。
（上述の通り、T7 RNAポリメラーゼは、「…TATA」の次のGを1番塩基として、そこからGG…とRNAを伸ばしていくからです。）
…と、正直、そんな微妙な違いを区別するって、何やこいつは、生きとるのか？目とか脳とかがあるんか？？…とか思うわけですけど（思わないかもしれませんけど(笑)）、まぁ改めて、単なる偶然による分子接触と結合の強さとから必然的にそうなるというだけの話でしかないんですが、あまりにもよくできすぎている気がするけれどそれが現実……本当にこういうニワカには信じがたいスゴイ性質をもっているのが、優れた生体分子だということですね。
これに関連して、より身近な話でいいますと、多くの人が既に接種を済ませたと思われるコロナワクチン、これはmRNAワクチンといわれているものですけど、この最重要部分・mRNAの合成は、恐らくこのT7 RNAポリメラーゼを用いて行われていると思われます。
まぁ僕はワクチン製造会社のインサイダーではないので実際の反応の詳細は分かりませんが、T7によるRNA合成は極めて効率がいいので、実際その他のRNA製の薬剤も普通にこいつの力で合成されることが多いですから、まず間違いなくワクチンもこいつらを使って作られている感じですね。
世界中に供給しているものですから、どんなサイズで製造しているのか見当もつきませんけど、恐らく巨大なバケツに大量のポリメラーゼと鋳型DNAとヌクレオチドNTPとを混ぜることで、めちゃくちゃな量が作製されていることでしょう。
いわば、T7は人類を救っているといえるのかもしれませんね。
（もっとも、T7以外にも、T3とかSP6とか呼ばれるプロモーター＆RNAポリメラーゼのセットは存在しますが（当然、由来となるファージが違うもので、プロモーター配列も異なります）、まぁ一番使われるのはT7かな、って感じです。）
（というか、ブルックヘブン国立研究所（BNH）のニュース記事(↓)に、ちゃんと「T7を使って作られている」という記述がありました。
www.bnl.gov
…元々T7のシステムはこのBNHで非常によく研究されて開発されてきたということで、写真におわします当時の研究開発グループのメインメンバー・Studierさんも、自分の研究が役に立って大層喜んでいるとのことですね。）
…という感じで、分子生物学の歴史でも長く使われてきたT7を例に、ようやく遺伝子スイッチの実物の一端を垣間見てみました。
次回は、このT7システムを今回のソーマチン実験例で使うために、大腸菌では実際にどうするのかについてちょろっと触れていこうと思います。
