唐突に始まった「最甘タンパク質ソーマチンを作ってみよう」講座、ここ何回か、ソーマチン遺伝子をプラスミドと呼ばれる「大腸菌に増やしてもらうためのスペシャルDNAリング」にクローニングするステップの説明で足踏みをしていますが、かなりややこしいながらも分子生物学・遺伝子工学で最も重要なものの一つで、分かればまあまあ面白い所でもあるので、無駄にじっくり語らせてもらってる感じですね。
ここさえ終われば後はちょちょいのちょいなので、順番に一つずつ進めていくとしましょう。
今回の記事で必要になるとは思えませんが（まぁ今まで一度も必要になったことはなかったですけど）、全体の流れを改めて貼り付けておこうと思います。
【大腸菌にタンパク質を作ってもらおう！】
1. 遺伝子DNAをゲットする！⇒済み！
2. そのDNAを、プラスミドに導入する（クローニング）！←今ココ
3. 使える形に加工したら、満を持して、DNAを大腸菌にぶち込む！
4. DNAがぶち込まれた大腸菌の選別！
5. 選ばれた「DNAがぶち込まれた大腸菌」をひたすら増やそう！
6. タンパク質合成のスイッチON！
7. 満を持して、目的タンパク質の収穫！
8. さすがにそのまんまでは大腸菌まみれで汚いので、キレイに精製しよう！
→見事、手元には大量の純品タンパク質が！やったね！！
前回・前々回で、DNAを特定の場所でスパッと切断する制限酵素について見ていました。
切った後はどうするのか？
当然、貼り付けるというか、つなげる操作が必要になるわけですね。
これを行うのも、例によって例のごとく、酵素すなわちタンパク質の力を借りることになり、DNA同士をつなげる「のり」のような役割のこの酵素は、DNAリガーゼと呼ばれるものになります。
まぁ相変わらず名前なんてどうでもいいんですけど（というか初めて何かを学ぶときって、何が嫌って、新しい名前が出て来すぎて嫌になりますしね）、これはligateという「結ぶ・つなぐ・結紮する」という意味の英単語で（特に、結紮するという専門用語チックなのがドンピシャですね）、これが酵素によくある名前「～ase」になったというだけの感じで、英語に詳しい人ならかなり覚えやすい名前かもしれません。
なお、ligateはライゲートという発音であり、DNA ligaseも、英語ではライゲースと呼ばれますが（でも、アメリカだけ？）、日本ではリガーゼと呼ばれることが多いですかね。
しかし、このDNAを連結する操作そのものは、日本人の学生から先生から全員等しく「ライゲーション」と呼んでいるので、「なぜ酵素はリガーゼ呼びのに、反応はライゲーションなのか…」という気も冷静に考えたらするものの、まぁ本当になぜかどこでもそう呼ばれている感じです。
（まぁ、みんなが普通リガーゼと呼んでいるのに、ライゲースとか呼んだらややこしいというか、「けっ！欧米かぶれ読みしやがって！」と思われてしまう気もするので（いやそんなこと思うやつはいないかもしれませんけど(笑)）、多数派に従うのが無難、って所でしょうか。）
ともかく、制限酵素で切ったDNA断片は、DNAリガーゼでつなぐことが可能となります（改めて名前については、「DNA連結酵素」の方が分かりやすいのに……って気もしますが、まぁリガーゼの方が慣れれば呼びやすいですし、覚えるしかない感じですね）。
しかし！
まぁ当たり前ですけど、切断面が同じ（…正確には「同じ制限酵素で切った」であって、配列は同じではなく「相棒のヌクレオチド」（A⇔T、C⇔G）となりますが）じゃないと、つなげることができません！
言葉では分かりづらいので、図で説明しましょう。
向きを分かりやすくするために、各鎖に色を着けるとともに、下に位置する相棒の鎖は、上下反転してみました（余計分かりづらい？）。
GGATCC、BamHIの認識配列（のある二本鎖DNA）ですね。
これをBamHIで切ると、ここ（G│GATCC）でスパッと切れます。
このBamHI切断面は、当然、この断面同士を再度つなぐこともできますし、下図のように、別のDNAをBamHIで切ったものをつなぐこともできます（別の色で示した、全く別のDNA）。
ただし！
別の制限酵素で切った切断面をもつ断片は、つなぐことができません！
例えばこちらはもう1つの代表的な制限酵素EcoRI（認識配列G│AATTC）で切った断片ですが…
これをBamHI切断DNAとつなげようとしても、突出部同士が手をつないでピタリと落ち着いてくれないので、ちょうど磁石のN極同士を近付けるがごとく、DNAリガーゼの力をもってしても、つなぐことができないのです！
面白いですね。
しかし、「同じ制限酵素で切らなければダメ」と上では書いたものの、さらにより正確には、制限酵素が違っても、実は「突出部位さえ同じならOK」なのです。
例えば、BglII（ビージーエル・ツー、またはベグルツー）という制限酵素は、認識配列がAGATCTなのですが…
突出している4文字（GATC）は、なんと、BamHIと共通なんですね。
なので、BglIIで切った断片と、BamHIで切った断片は、つなぐことが可能です！
ただし、出来上がった連結DNAはこんな感じで…
GGATCTとAGATCCという、BamでもBglでもどちらからも1塩基違いで認識されない配列になってしまい、二度とBamHIでもBglIIでも切れないDNAが爆誕してしまうことになります（まぁ、もう切る必要がないなら、別にそれでもいいんですけどね）。
できたDNAは、パッと見「ほぼBamじゃん、ほぼBglじゃん」とも思えますが、マジでこいつらの配列認識能力は厳密厳格完璧で、冗談や誇張抜きに、本当に100：0の割合で、このBam-Bgl連結DNAはどちらの酵素でも完っ全に切れなくなるってんだから、面白いというか実によくできたシステムになっているのです。
なお、制限酵素断片を貼り付ける際のもう一つの注意点として、「認識配列は二本鎖で回文になっている」という点も挙げられます。
つまり、このBamHI断片に…
この青緑DNAをBamHIで切った断片をくっつける場合、
（さっきも見ていた）こうなるパターンと…
さらに当然、こっちの切り口がつながるパターン…
…の両方があり得るのです！
続きの部分が「・・・」なので分かりにくいですが、これらは全く別の連結DNAが生まれることになりますね。
どっちが得られるかは完璧に運で、まぁ50％の確率ですから、両方のパターンが存在して、配列を自分の目で確かめてみるまではどちら向きにつながったのかが分からないのです。
（まぁ、現実的には、50-50ではなく、大抵の場合、なぜか「どちらか一方の向きが圧倒的に入りやすい」ことがほとんどですが、10：0にはなりません。必ず、どちらも生じます。）
なので、目的遺伝子をプラスミドに挿入する際、入れたい向きが決まっているような今回の場合（タンパク質合成方向が決まっているので）は、2つの制限酵素で切断してあげて、つなげる向きを確定させるということがよくやられるわけです。
前回もそのことをちょろっと書いて、詳しくは次回…としていましたが、今回もスペース不足につき、詳しくは次回とさせていただきましょう。
最後、DNAリガーゼについて、せっかくなのでもうちょい詳しいメカニズムにまで触れておこうと思います。
こんなのあまりにも細かすぎる話で、入門編ではマジで要らねぇ話でしかないんですけど、実際僕自身、学生で最初に習ったばかりの頃は全く意識していなかった話であり、周りを見てても専門で学んでる人・実際にDNAリガーゼを使ってる人ですらたまにきちんと理解してない可能性のある話なので、例によってもし専攻で勉強を始めたばかりの学生さんとかがいたら、その人向けに「この辺も抑えておくといいよ」という、まぁいわば昔の自分に向けてのメッセージみたいなものですね。
結局また分子レベルの結合の話なんですけど、DNAリガーゼは、具体的には、DNAの5'末端（先頭）にあるP（リン酸基）と、3'末端（お尻）にあるOHとをつなげます。
よく分かる有機化学講座の第一回で一瞬だけチラッと触れていた話なんですが、DNAを構成するヌクレオチドは、Pを介してつながっているのでした。
つまり、例えばGGATCCというDNA文字列をもっと拡大して、文字間のつながりがどうなっているかまで明示して書いてみると、こんな感じになっているんですね。
5'-・・・-P-G-P-G-P-A-P-T-P-C-P-C-P-・・・-3'
そして、制限酵素は、切断面の先頭になる（新しい5'末端になる）塩基にPが残り、末尾に残る（3'末端になる）塩基にはOHを付加する形で切断することが知られています。
なので、これをBamHIで切ると、
「・・・-P-G-OH」と、「P-G-P-A-P-T-P-C-P-C-P-・・・」という切断面の断片が生まれる、ってことですね。
（ちなみに、反対向きの相棒の鎖も全く同じです。）
ということで、制限酵素断片は、切ったそのままの状態で即DNAリガーゼによるライゲーションに使える形になっており、これは遺伝子工学実験をする人にとってラッキーだったといえましょう。
もしこれがお尻にP、先頭にOHを残す形で切れていたら、DNAリガーゼを使うことはできなかったわけですからね（まぁ、もしそうだったら、「お尻にP・先頭にOHの形のDNAをつなぐ酵素」を使っていただけかもしれませんが）。
なお、この性質から、制限酵素切断面の先頭のPを取り除いてやると、DNA断片は結合ができなくなることになります。
具体的には、P、つまり「リン酸基」を除いてやるということで、「脱リン酸化」と呼ばれる工程ですが、これを実行するのは「アルカリフォスファターゼ」という酵素になります。
（相変わらず、名前なんて本当にどうでもいいですが、こちらは英語表記の頭文字を取って「AP」（英語でもそう呼ばれることが多い）とか、「アルフォス」（これは日本人だけ）とか、それより日本人がよく呼ぶパターンは、よく使われるやつがバクテリア（これも何気に大腸菌がほとんどですが）から取られたAPなので、「BAP」（バップ）とか、子牛の小腸 (Calf Intestine) から取られたAP（扱いやすいので、よく使われます）で「CIAP」（バップに倣って「シップ」と読む人がなぜか多いですが、個人的には「この文字の並びでシップか…？」って気もしますけど(笑)）とか呼ばれます。
最後の2つは、最もよく使われているであろう、TaKaRaの商品名にもそう書かれてますしね。チューブのキャップに、「BAP」とか「CIAP」と書かれていたはずです。）
それの何がどうなんだというと、例えばプラスミドを制限酵素で切って、同時にAP処理して切断面の先頭にあるリン酸基を除いてやれば、「プラスミドの切断面同士がくっついてしまう」ことが避けられるんですね！
まぁ、2つの制限酵素で切ってやれば、断面が違うので、（ちょうど先ほど図付きで説明したとおり）「プラスミドの切断面同士がくっつく」ことにはならないのですが、例えば、（メジャーな制限酵素は本当によく切れるのでほとんど切れ残りはないけれど）マイナーな制限酵素なんかですと、値段が高いくせに全然切れないなんてことも稀によくあり、そういう酵素を使う場合、「ほとんどが、切れやすい酵素で切った側の一方しか切れない」なんてこともあるわけです。
そのとき、AP処理も同時にしておけば、一方だけ切れたものが仮に存在しても、ライゲーション時に、それが再度つながって完全な環状プラスミドに戻ってしまうことを防ぐことができるんですね（「セルフライゲーションを防ぐ」とよくいわれます）。
DNAリガーゼによるライゲーション反応は、「プラスミドと自分の入れたい遺伝子DNA」という2分子間で起こるものより、「プラスミドの切断面同士」という、分子内で起こるものの方が遥かに効率がいいので（全く別々に存在する2つのものをつなぐのより、1つのものの両端をつなげる方が遥かに楽なのは想像がつきます）、なるべく「プラスミドと自分の入れたい遺伝子」を連結させてやるべく（言い忘れてましたが、これがライゲーションを行う目的ですね。つまり、実験の成功率UPのため！）、制限酵素処理とAP処理はよく同時に行われます、という話でした。
（注意点として、当然、「挿入させたい遺伝子DNA」の方もAP処理してしまうと、実験が完全に失敗します！！
挿入させたい側にはリン酸基を残しておかないと、DNAリガーゼは連結することができませんからね。
APは非常に反応効率のいい酵素で、ほぼ100％確実にDNAの末端を脱リン酸化するので、間違えてプラスミド＆挿入遺伝子DNAの両方をAP処理しちゃったら、マジで100％完璧に絶対失敗します。）
…と、恐らく実際の実験をやったことがない方にはチンプンカンプンな話だったかもしれませんが（多分、僕自身、もし一度もやったことなかったら、「何いってんだコイツ」となってますしね(笑)）、まぁ実際にやれば分かる＆実際にやるときに、成功率をUPさせる上手いコツということで、最後にちょろっと触れてみた感じでした。
（ちなみにどうでもいいついでに、脱リン酸化酵素であるAPの逆、リン酸化酵素は、キナーゼという名前で呼ばれます。
納豆キナーゼとか聞いたことがある気がしますが、これはリン酸化酵素のことなんですね（まぁ、だから何だよ、って話でしかないですけど(笑)）。
なお、kinaseは、英語では「カイネース」と呼ばれます。基本、「～ase」は日本語読みの「アーゼ」ではなく「エース」になるのが、なんとも厄介な違いかもしれません。）
では、制限酵素とリガーゼの話をしたところで、次回ようやく具体的なやり方を見ていくとしましょう。
