前回の記事、書いてて「これ大丈夫か…？」と思えるレベルの、何というか専門的すぎて、流石にこれは触れんでよかったんとちゃいます…？と、書き終えたあとに正直内心忸怩たる思いを抱いていたんですが、まぁ始めちゃったんで続けるとしましょう。
楽しい大腸菌タンパク質クッキング講座、ステップ2を見ている段階です……
【大腸菌にタンパク質を作ってもらおう！】
1. 遺伝子DNAをゲットする！⇒済み！
2. そのDNAを、大腸菌が使える形に変換する！←今ココ
3. 使える形に加工したら、満を持して、DNAを大腸菌にぶち込む！
4. DNAがぶち込まれた大腸菌の選別！
5. 選ばれた「DNAがぶち込まれた大腸菌」をひたすら増やそう！
6. タンパク質合成のスイッチON！
7. 満を持して、目的タンパク質の収穫！
8. さすがにそのまんまでは大腸菌まみれで汚いので、キレイに精製しよう！
→見事、手元には大量の純品タンパク質が！やったね！！
前回、大腸菌に目的の遺伝子DNAを導入して、保持＆活用（大腸菌が分裂するときに一緒にコピーされる＆必要なときに遺伝子のスイッチを入れるなど）してもらうためには、裸のDNAではダメで、これをプラスミドと呼ばれるリングDNAに組み込んでやらなければいけない、などということを書いていました。
ちなみに、プラスミドDNAのことを、Vector（ベクター）とも呼ぶこともあります。
まぁベクターというのは、オンラインのPCソフトウェアサイトの名前でもありますけど、数学用語ではベクトル、英単語の意味としては向きと大きさを持つ矢印的なイメージ、転じて「運び屋」とか「媒介者」とかいう意味がありますが、生命科学ではまさにDNAを他の生物に導入するために乗せる乗り物とでもいいますか、「DNAを組み込んで運ぶための、より大型のDNA」的な感じの、「プラスミド」よりも広い意味で使われる言葉ですね。
（例えば今回の例ではプラスミドをベクターとして使っていますが、実験によってはウイルスをベクターとして使うことなんかもあり得ます。結局、ベクターという用語は「運搬容器」みたいな感じといえましょう。）
相変わらず本筋とは直接関係ないところで無駄に長くなってますが、例によって用語なんてどうでもいいんですけど（でも使わざるを得ないので、一応説明した感じです）、このプラスミドベクターに、今回例として取り上げている甘口タンパク質・ソーマチンのアミノ酸配列を指定する遺伝子DNAを組み込んでやろう、という話ですね。
そもそも「組み込む」って何やねん、って話かもしれませんが、くどいですがプラスミドもソーマチン遺伝子も、どちらも同じ、ただA, C, G, Tの4文字がひたすらつながっただけのDNAなわけです。
つまり、どっちも同じただの文字列なんだから、ちょうど文章をコピペするがごとく、プラスミドDNAの並んでる文字列をちょっと開いてやり、そこにソーマチン遺伝子DNAの文字列を挿入してやれば、それだけで無事組み込み完了となる……という、特別ややこしくもない実に単純明快なコンセプトなのでした。
（結局、こういう作業を行うから、この一連の流れで作られるタンパク質のことを「組換えタンパク質」と呼んでいるのかもしれません。）
しかし、「『DNAを開く』って、一体どうやって？」というのは当然疑問点として生まれると思うんですけど、それが今回のテーマですね。
順番に説明させていただきましょう。
まず、前回、使うプラスミドの例として、pET-15bという名前の、世界中たくさんの研究室でめちゃくちゃよく使われているものを紹介していました。
（※※※改めておさらい：プラスミドとは、「大腸菌が、分裂するときに一緒にコピーして増やしてくれるシグナル配列」「大腸菌が、そのプラスミドを取り込んだかどうか判別できるようになる選別マーカー」「大腸菌が、自分の入れた遺伝子をタンパク質に合成してくれるためのスイッチ」などの機能（をもたらすDNA配列）をもった、単なるDNAリングのことなのであ～る。
(なら「DNAリング」って呼べばいいじゃん、余計な単語覚えさせるなよ…っていう気もするものの、まぁ歴史的にそう呼ばれてるのでしゃあない、郷に従いましょう、って感じですね。)
プラスミドが導入された大腸菌は、そのプラスミドのもつ特殊能力を獲得できるというわけなのであ～る！※※※）
プラスミドマップ（「ベクターマップ」という言葉の方がよく使われますが、まぁ同じ意味ですね）の画像が、こんな感じ↓でした。
再掲しましょう。
（何度も書いている通り）プラスミドは環状なのでリングで描かれており、重要な部分は矢印とか四角でハイライトされていますが、結局の所こいつは、5708文字のヌクレオチド（A, C, G, Tのいずれか）が並んで、1文字目と5708文字目がつながることで環状化した、何の変哲もないDNA分子にすぎないのです。
もちろん、5708文字、配列は全て明らかにされています。
こんな感じに。
Addgeneという、プラスミドデータベースを構築して無料で公開（しかも、上記のように、適切に色々なハイライトを施してくれる、めっちゃ便利なWebサイト含め）してくれている非営利団体が存在します。
Addgeneではプラスミドの販売も行っていますが、伝統的に、プラスミドは研究者間で無償でやり取りされることが多いものの、pET-15bとかはNovagen社が開発したもので、本当はお金を払って購入とかしないといけないのですが、大学などのアカデミック研究で使う範囲では無償譲渡も黙認されているのが現実といえるかもしれません。
（本当はダメみたいですけどね。でも、pET-15bみたいに世界中で汎用されまくっているベクターは、既に何らかの遺伝子が挿入されたもの含め、気軽にリクエストされることが多く、（pET-15bではないですが）僕も何度も自作のプラスミドを色んな国の研究者に郵送したことがあります。）
…とまぁそんな雑談はともかく、Addgeneのデータベースは本当に便利で、プラスミドの配列を確認するのによく使われており、上記画像のリンクが、pET-15bの配列込みのデータですね。
画像では一部分しか表示されていませんが、リンクにアクセスすれば分かるとおり、5708塩基全長の配列が確認できるようになっています。
さて、このプラスミドDNAというのも結局文字列にすぎないということが分かったところで、一体どうやってソーマチン遺伝子をこいつに挿入してやるか…？です。
ここで登場するのが、タイトルに挙げた制限酵素！
マジで何でそんな名前なん？と思える、分かりにくすぎる名前なんですが（ちなみに英語でもrestriction enzymeで、直訳そのまんま「制限酵素」になります）、これはズバリ、DNAを特定の場所でスパッと切る、一言でいえばDNA切断酵素になります。
制限酵素の最大の特徴は、酵素によって切る場所が完全に決まっており、100％確実に目的の場所をカットできることが挙げられましょう。
そしてその「場所」というのは、基本的に6文字（4文字や8文字の場合もありますが、メジャーな酵素のほとんどが6文字）のDNAで決まっているのです。
つまり、例えばGGGCCCという6文字があったとしましょう。
この6文字は、ApaI（アパワン）という制限酵素の担当で、DNAとApaIを混ぜると、そのDNAに含まれるGGGCCCという6文字が並んでいる場所は全て、見事に切断されます。
ちなみに、ApaIは、この6文字以外は絶対に切断しません。
GGCGCCみたいな惜しい感じだろうが、CCCGGGみたいな「逆から読めばGGGCCCじゃん」と思える形だろうが何だろうが、6文字がピッタリGGGCCCでない限り絶対に手を出すことはしない、侍のような忠誠心をもっているのです。
（ちなみに、GGCGCCはKasI（これはマイナーな制限酵素なので、僕は一度も買ったことも使ったこともありませんが）、CCCGGGはSmaI（スマワン）という制限酵素の担当となります。）
そして、切り方も完全に決められています。
DNAは二本鎖なので、二本の鎖が手をつなぎあっている状態のものを切り開くようにカットするわけですが、ApaIの場合はこうなります。
（価格表とか別に不要ですが、まぁ画像最下部のやつが、切り口を示してくれている感じですね。
なお、改めておさらいですが、DNAには向きがあり、上の鎖が左から右に進む向き（5'→3'方向といわれます）で描かれている場合（何の断りもなければ、普通はそう描かれます。この場合もそうですね）、下の鎖は、逆方向、3'←5'という向きで存在している形になっています。）
切り口も酵素によってマチマチで、例えばSmaIであればこんな感じで…
切断面は平らになる感じですね。
初めて見た場合だと想像しにくいかもしれませんが、当然、DNAはこの6文字以外にも、左右にずっと文字列がつながっているので、例えばApaIで切断した場合ですと、
↑こういう、上の鎖が4文字分出っ張った部分と、
↑こういう、下の鎖が4文字分出っ張った部分が出来上がるわけです。
もし切断に使ったDNAがプラスミドのようなリング状だったら、この2つは「・・・」で伸びてる部分がぐる～っと一周まわってつながっていますから、結局ひとつながりの直線状DNAが生まれた形になりますね（リングが開いたということ。ApaI切断面が両端になります）。
一方、もともと直線状だったDNAをApaIで一箇所切断した場合、左半分と右半分の、2つの断片が発生する形になるわけです。
（もちろん、GGGCCCという文字列がDNA内部に複数箇所あったら、その分だけ断片が増える感じになります。）
文字でいうと分かりにくいかもしれませんが、恐らくイメージできるのではないかと思います。
ここで更にもう一つ面白い話として、制限酵素の認識配列は、必ず、左から読んだものと、（二本鎖の相棒を）右から読んだものが一致する形になっています。
（GとCのみで分かりにくいですが）、先ほどのタカラバイオの切断面画像が分かりやすいですけど、ApaIなら上の鎖がGGGCCCで、下の鎖を右から読むと、これまた全く同じGGGCCCとなっていました。
もうちょい分かりやすい例として、別の文字（AとT）も混ぜてみましょうか。
一例として、最もメジャーな制限酵素の1つであるBamHI（バムエイチワン）であれば、こいつの認識配列は、GGATCCとなります。
切断面はこんな感じ。
上の鎖がGGATCC、下の鎖も、右から読んだらGGATCCになってますね。
要は、「上から読んでも山本山、下から読んでも山本山」のパターン、いわゆる回文になってるということですね。
（まぁ、認識配列自身は回文でも何でもないので、「これを回文と呼ぶのはどうなん？」と正直思いますが、「制限酵素認識配列は回文構造」とよくいわれています。）
つまり、6文字を認識するとはいえ、最初の3文字が決まった時点で、「二本鎖の相棒が反対読みでそれと同じになる」という回文ルールから、後半の3文字も確定するので（おさらい：DNAの二本鎖は、A⇔T、C⇔Gが手をつながることもルールとして決まっているので、相棒の文字が決まれば。自分の文字も確定します）、実質最初の3文字で、その制限酵素の認識配列は決まっているも同然ということなんですね。
（例：BamHIの最初の3文字はGGA→二本鎖の相棒は、回文ルールにより右からGGAが下に陣取ることになる→なので、それとペアになっているということは、後半3文字はTCCとなることが自動的に決定。）
…と、そんな面白い性質の制限酵素ですが、プラスミドマップに大量に表示されていたアルファベットの文字列、こいつらは全て制限酵素の認識部位（切断部位）を示していたのです！
もう遥か上の方になってしまったので、同じ図ですが改めて貼ってみましょう。
このプラスミドマップの内、「右上にある黒塗り矢印のところに、目的のソーマチン遺伝子を挿入します」と前回書いていました。
つまりどうすればいいかというと、ちょうど太字になっているBamHI、XhoI、NdeIの中からお好きな制限酵素でまずこのプラスミドをカットして、その開いた部分にソーマチンをつなげてやれば万事OKということになるわけですね。
ちなみに、大抵の場合、2つの制限酵素で切ってやることになるわけですが、1つはBamHI（理由は、メジャー酵素なので、クソ安だから。価格表をご覧になると分かる通り、BamHIは、ApaIのほとんど半額程度、SmaIに至っては、1/5以下の値段（SmaIの6300円は、たった2500 U（ユニット）しか入っていません！同じ1万ユニットで比べれば明らかですね）になってる通り、一番安く、また一番使われている制限酵素がこいつです）、そしてもう1つは……まぁ僕ならNdeIを選ぶかな、って感じですかね。
（ちなみに、上で貼ったAddgeneの配列画像では、BamHIの部分をハイライトしていました。NdeIの認識配列はCATATGですけど、BamHI（GGATCC）のすぐ後ろにいることも確認できますね。）
それら2つを選ぶ理由、並びに、制限酵素を使ってどうやってソーマチン遺伝子を挿入するのかの具体的な話は、長くなりすぎたのでまた次回へ続く…とさせていただきましょう。
