フェノクロの実際(前半:混ぜて分ける)

唐突に始めていた「DNAを見てみよう」のコーナーから、唐突に深入りしていたフェノールについて、前回までで「なぜフェノールと混ぜることでDNAだけ選択的に取り出せるのか(タンパク質は上手いこと除けるのに)」という点を簡単に説明していました。

 

文字だけでの説明で分かりづらかった中に、解説サイトのイラストも加わって中々分かりやすいものになってくれたのではないかと思いますが、さらに分かりやすいものとして、実際のフェノクロ処理と、更にはその次のDNAを可視化する(まぁ目的は「見ること」ではなく、「沈殿として沈めて純品を得ること」ですが)エタノール沈殿、通称「エタ沈」(英語なら、ethanol precipitationを多少略して、「EtOH ppt」などと記述されることが多いです)の実践を紹介してくれている動画を紹介し、スクショを撮ることでちょこまか補足説明を加えるという水増し蛇足記事をこさえてみるといたしましょう。

 

動画については、やはり英語の方が種類が豊富だったので英語ではありますが、まぁ単に操作を見せる動画で一言も言葉を発していない、文字字幕のみのものだったんで問題ないでしょう、こちら、抗体作製で名高いAbnova社(今調べたら、台湾の会社だったんですね。アメリカでもよく目にします)が公開してくれていた「DNA Extraction by Phenol Chloroform(フェノール・クロロホルムによるDNA抽出)」というYoutube動画をお借りさせていただきました。

 

www.youtube.com

 

主だったステップについて、スクショを交えて見ていこうと思います。

以下、全て上記動画よりのスクリーンショットです。

 

1. サンプル=細胞懸濁液の用意

00:19ぐらい

Add 700 μl lysis buffer into cell pellet and resuspend cells

=700マイクロリットル(0.7 mL)の溶解液を細胞のカタマリに加え、細胞を懸濁する

 

まずは、植物からすり潰して得たものなり、動物の臓器から得たものなり、培養細胞なりから得た細胞のカタマリに、適当な塩や界面活性剤を加えた抽出液を加えてやります。

これはまぁ、前回のイラストでも軽く見ていた通り、フェノクロ処理後には上層に位置する水の層を吸うことでDNAだけをゲットするわけですけど、体積が小さすぎると十分な水の層が生まれず思うように分かれてくれませんから(少なすぎると吸いづらいですし)、体積アップの意味合いが強い感じですね。

 

ちなみに、動画ではこの後にRNase A(RNA分解酵素A)と、さらにはProteinase K(タンパク質分解酵素K)も加えて、RNAとタンパク質を積極的に破壊しているステップもありましたが、「欲しいのはDNAだけで、RNAは要らない」という場合はRNaseを加える必要がありますけど、タンパク質に関しては、よっぽどめちゃくちゃ大量の細胞を扱うとかでもない限り、別にあえて積極的に分解してやらなくてもタンパク質は除けますから、プロKを使うことはあんまりない感じがします。

(もっとも、本当に研究用途に依りますけどね。不要と考えられるなら、時間・試薬コストなどのあらゆる面で、無駄な工程は行いません。)


その辺の前処理は必須ではなく、あくまで「任意追加ステップ」だといえましょう。

 

2. フェノクロ溶液を加える

01:09ぐらい

Add 700 μl Phenol/Chloroform/Isoamylalcohol (25:24:1)

=700マイクロリットル(0.7 mL)のフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール(25:24:1の比でミックス)を加える

 

そして細胞懸濁液に、フェノクロ溶液を加える感じですね。

 

ここでは、「フェノール」ではなく、「クロロホルム」と「イソアミルアルコール」という別の試薬を混ぜた、通称「PCI」などと呼ばれる(まぁ日本語なら「フェノクロ」の方がメジャーな気もしますけど)混合液を使っています。

 

その辺についても補足を加えたい所ですが、とりあえずステップを進めましょう。

 

3. よく混ぜる

01:15ぐらい

Mix well

=よく混ぜる

 

この動画ではピペットを使って、液を出し入れして混ぜ混ぜしてますけど、ここはもっと激しく混ぜた方がいいとされてますし、フェノクロは有機溶媒で揮発性が高く、ピペットで吸って吐いて…を繰り返すと、ピペット内部の構造を腐食してしまいがちですから、僕なら絶対こうはしないですねぇ~。

 

もし学生がやってたら、「いやそうするメリットが何もないから、それはやめよう」と言って、「チューブの蓋をしめて、上下に思いっきり振る」という方法か、あるいは前回のイラストでは「ボルテックス」という謎の語があったのに触れてませんでしたけど、生化学実験で汎用される実験機器に「ボルテックスミキサー」というものがありまして…

 

ja.wikipedia.org

 

…こういう、上部のゴムにチューブを押し付けると凄まじい勢いでブルブル震えて中身を撹拌できるという装置ですけど、まぁフェノクロの場合、油チックな有機溶媒であり案外フタから漏れやすいので、僕はフェノクロではボルテックスを使うこともあまりせず(漏れると悲劇ですしね)、親指と人差し指でしっかりフタとチューブの底を抑えながら、上下に思いっきり振る…

(学生時代の先輩に、「チューブを垂直に立てて、上下に振ると、最高効率で振れるよ」と教わり、実際適当に握ってランダムな方向にシャカシャカ振るより完全に上下に振ると本当にめちゃくちゃ効率よく混ぜられるので、僕は上下振りを徹底していますが、まぁそんな細かい点は割とどうでもいいでしょう(笑))

…という形を取っていますけど、一応動画の「ピペットで液体出し入れ」という混ぜ方でも、水とフェノールが混ざって白濁している様子は窺えますね。


こういうのは実際に見てみないと分からないものなので、(あんまり褒められたやり方ではないとはいえ、様子を紹介してくれるのは)大変ありがたい説明だといえましょう。

 

4. 遠心分離する

01:28ぐらい

Centrifuge at 13000 rpm for 10 minutes

=1万3000 (回転/分) で、10分間遠心する

 

そして、混ぜた溶液入りチューブを、高速遠心機で回してやるわけですね。


分速1万3000回転ってのは、この手の小型遠心機のほとんどのタイプでの最高速度であり、要はMaxスピードで回すわけですけど、車のエンジンは高速道路を走ってる時でも4000 rpmぐらいですから、高速全力モードの車よりも数倍早い回転数ってことで、結構なスピードだといえましょう。

 

前回も書いていた通り、こうすることで、液体というのは密度に応じて綺麗に分離されますから、上が水・下がフェノクロ層に、綺麗に分かれくれる形です。

 

5. 上層にあるDNAを新しいチューブに移す

01:48ぐらい

Pipet aqueous phase into a new tube

=水層を新しいチューブにピペットで移す

 

前回イラストなどで見ていた通り、上に来た水の層にはDNAが溶け込んでおり、一方、行き場をなくしたタンパク質は、ちょっと見づらいですがチューブの真ん中辺りの中間層に、白い塊として横たわっていて、その下にフェノール層が来ている…ということがお分かりいただけるかと思います。


せっかく除けたこの白いタンパクカスを吸わないように、慎重に上層だけをピペットで吸って、新しいチューブに移してやるわけですね。

 

6. フェノクロ処理を繰り返す

02:07ぐらい

Repeat [Add phenol/chloroform/isoamylalcohol into aqueous phase → Centrifuge → Collect aqueous phase] steps for 2 times 

=「フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコールを水層に加える」ステップを2回繰り返す

 

まぁこれも後で触れたい所ですが、先ほどの画像ぐらい大量のタンパク質がある場合、まだ完全にタンパクを除ききれていない可能性が高いので(実際、水層も白く濁っていました。まだ汚いですね)、フェノクロを繰り返す必要があるかもしれませんが、そこまで汚いサンプルを扱っているわけではない(あるいは少量の細胞しか扱っていない)ような場合、普通にフェノクロは1回でも問題ありません。

 

同じように、以下の7-8番、「クロロホルム単独処理」ステップも、「optional」(必須ではなく、必要に応じて)って感じといえます。

 

7. DNA水溶液にクロロホルムを加える

02:18ぐらい

Add 700 μl chloroform

=700マイクロリットル(0.7 mL)のクロロホルムを加える

 

(僕はほぼやりませんが)フェノクロを繰り返した後の水層に、新たにクロロホルムを加える→よく混ぜる→遠心…と、完全に同じことをクロホ単独でもやるステップを行う(人もいる)感じで、遠心までの画像はもう省略しましょう。

 

8. 上層にあるDNAを新しいチューブに移す

02:57ぐらい

Pipet aqueous phase into a new tube

=水層を新しいチューブにピペットで移す

 

これも先ほどのステップ5と完全に同じですが、繰り返しただけあって水層も透明で綺麗になり、また、中間層のタンパク質もほとんどなくなっていることが見て取れるように思います。

 

なぜクロロホルムを使うのか(単独でのみならず、最初にフェノールと混ぜる形でも)、その辺の補足をつけていこうと思っていたのですが、時間切れとなってしまいました。

 

そこについては、また次回(あるいは全行程触れ終えた後)、改めて見てみようかなと思います。

 

今回はただ動画をなぞっただけでしたが、そこそこ実際の実験の様子がお分かりいただけた感じではないかと思います。

使ってる使い捨てゴム手袋が何か汚ぇ点含め、これはリアルですね(笑)。

それでは補足他はまた次回……。

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