様々な補足知識を経て、またここへ戻ってきました。
これまでの種々の話を飛ばしていたら、正直何のこっちゃ分からん感じだったかもしれないので、結構いい回り道だったかもしれませんね。
改めて、ギザ甘物質ソーマチンを作ろう実験の続き、まずはもう何度も貼ってる流れを一応確認しておきましょう。
【大腸菌にタンパク質を作ってもらおう！】
1. 遺伝子DNAをゲットする！⇒済み！（遺伝子を注文しよう！）
2. そのDNAを、制限酵素とDNAリガーゼを使って、プラスミドに導入する（クローニング）！⇒済み！（図を見れば一発？！改めて、分かりやすくDNA切り貼りの仕組みを紹介！）
3. その遺伝子組込みプラスミドDNAを大腸菌にぶち込む（形質転換）！⇒済み！（たった数日で1000万円分のモノが作れる、楽しい作業）
4. DNAがぶち込まれた大腸菌の選別！⇒済み！（遺伝子をぶち込まれたやつだけが生き残れる、サバイバルゲーム！）
5. 選ばれた「DNAがぶち込まれた大腸菌」をひたすら増やそう！⇒済み！（DNAを増やそう）
6. タンパク質合成のスイッチON！←ついにココ！
7. 満を持して、目的タンパク質の収穫！
8. さすがにそのまんまでは大腸菌まみれで汚いので、キレイに精製しよう！
→見事、手元には大量の純品タンパク質が！やったね！！
まぁ一部のステップは適当にすっ飛ばしてる部分もありますが、その辺もこないだの記事なんかで補足していたので、あやふやな際はそちらを参考にしていただければと思います（なおも不明なら、いつでもドシドシご質問募集中です。）
…ということで、ついに目的の物質であるソーマチンタンパク質合成のスイッチON！
…と、ずっと「タンパク質合成のスイッチON」と書いてましたが、ここまでの話を抑えてこられた方ならピンと来るというか「あれ？」と思われるかもしれないこととして、これは何気に「RNA合成のスイッチON！」でしかなく、「タンパク質合成のスイッチ…？」というのが謎ポイントだったかもですね。
実は、RNAができたら後は自動で大腸菌が勝手にタンパク質まで作ってくれるだけなので、これはちょっと正確性に欠ける表現だったかもしれません。
一番誤解も招かないし良かったのは「遺伝子発現のスイッチON」あたりの表現でしょうが、まぁ「タンパク質ON」でも意味は分かるし完全に間違ってはいないので、固いことは言いっこなしでその辺適当に、ニュアンスというか雰囲気みたいなもので乗り切りたい限りです。
その辺の細かい言葉の使い方に関する御託はともかく、遺伝子スイッチについておさらいしておくと、この実験で使っているpETシステムでは、ラクトースオペロン（というか、特にlacオペレーター）を用いていました。
オペロンについてはこの記事を皮切りに割と細かく見ていましたが、こちらもおさらいしておきましょう。
- lacIという名のリプレッサー（抑制物質）がlacオペレーターに結合して遺伝子スイッチONの邪魔をしている
- しかし細胞内にラクトースが増えてラクトースがlacIに結合すると、lacIは形が変わってオペレーターに結合できなくなる
- その結果、邪魔者が消えてプロモーター領域にRNAポリメラーゼがくっつけるようになり、遺伝子DNAからRNAが合成される、いわゆる転写反応が行えるようになる！
…という感じでした。
ということは、自然に考えて、ソーマチン実験でも、スイッチを入れるにはラクトースを加えるってこと？と思えるわけですけど、そこには微妙に罠があるのです。
そもそもラクトースオペロンは大腸菌の中にあるもので、ラクトースを加えることでラクトースオペロンが全てONになりますから、pETシステムで採用されている遺伝子のみならず、大腸菌が元々もっているラクトースオペロン制御下の遺伝子、ラクトース分解酵素にもスイッチが入ることになるんですね。
その結果、せっかく加えたラクトースが分解されることになりますから、その内また勝手にスイッチがOFFにされてしまうことにつながり、これはよろしくないわけです。
（おさらいですが、ある程度大腸菌が増えるまではスイッチをOFFにすることで、作りたいタンパク質に万一毒性があっても気兼ねなく大腸菌にスクスク増えてもらう→いざある程度菌が増えたら、もう元気に分裂できなくなろうが死のうが何しようが構わないから、スイッチをONにしてひたすら望みのタンパク質を作り続けてもらいたい…というデザインの実験だった感じですね。
そういう意図であるから、せっかくスイッチをONにしたのに、しばらくしたらスイッチがOFFに戻されてしまうなんてのはご勘弁いただきたい、ってな話ってこってす。）
そこでどうするか？
そこで使うのが、「ラクトースに似ているから、（lacIに結合して、OFFスイッチをOFFにすることで）スイッチはONにできるけど、大腸菌が作るラクトース分解酵素では分解されない」という、「いやいや都合よすぎ(笑)」とも思えるようなラクトース類似物質、IPTG！
このIPTG、地味に以前、「青白セレクション」について触れていたこの記事なんかでも登場していたんですけど、まぁ青白セレクションもいわばlacオペロンの仕組みを使ったテクニックなのである、って話だったんですね。
その記事では「入門編では不要でしょう」という感じで全く触れていなかった＆オペロンなんて触れる予定もなかったので、IPTGの構造すら見ていませんでしたが、正式名はイソプロピル-β-チオガラクトピラノシドという（でも長いので、略してIPTG呼びされる）、こんなやつです。
…って相変わらず、分子構造なんて見ても別に何も分からないというか、「まぁ確かにラクトースに似て……るか？いや、似てなくない？」としか思えないですけど、そういえばこれも触れていませんでしたが、実はlacIに結合するのはラクトースではなく、ラクトース分解酵素の機能の一環で微妙に形を変えられたアロラクトースという形の分子なんですけれども、まぁ結局アロラクトースとも全然似てないじゃん、って感じかもしれません(笑)。
いずれにせよ、分子的には似ている扱いされているこのIPTGは、lacIに結合して形を変えることができるけれど、ラクトース分解酵素の餌食にはならず、ひたすらlacオペロンをONにし続けることができるという、非常に実験者にとって都合のいい分子ってことなわけです。
ちなみに、また実験の全体像を振り返るときに、具体的な培養の量とか操作手順については改めて詳しく触れようかと思っていましたが、ちょうどこのステップの話なので雑談程度に簡単に軽く触れておくと、まぁ当然欲しいタンパク質の量にもよりますけど、よくやられるのは、大腸菌を1リットルとか2リットルのLB液体培地で培養する感じですね。
培養に使う容器は実験器具でおなじみ三角フラスコであることが最も多いですが、培養の際はフラスコの満タン近くまで培地を入れると上手く混ぜられない（フラスコはシェーカーで回転させながら培養しますけど（小型のシェーカーの例はこの記事なんかで見てましたね）、空気の接触＝エアレーションとかも重要なので、菌の培養の際は、フラスコの容量の半分…でも多すぎるぐらいで、総容量の1/4とか1/8ぐらいの液量に抑えることが推奨されています）ので、1 L（リットル）の菌を培養したい際には、4 Lフラスコとか、それ以上大きいと特注になるかもしれませんが5 L、6 Lフラスコとかを使うべきといえる感じですね。
ただ、でかすぎるフラスコだと扱いも大変なので、例えば合計2 Lの菌を培養したい場合なんかは、4 Lフラスコに500 mLずつ入れて行われる…なんてことも多いといえましょう。
（そもそも、最終的に菌が増えた培地は遠心して菌体を落とすわけですが、遠心機にはバランスよく回るように、軸を対称として偶数本のサンプルを乗せる必要があるので、2本とか4本に分けて培養するのが賢いのです。
…まぁ別に1本でも、水入りのボトルでバランスを取ればいいだけですけどね。）
また、ずっと書いていた「（スイッチONにするまで）ある程度菌体を増やす」という点ですが、大腸菌が培地の中にどれだけいるかは、培地の濁り具合で簡単に測定できるんですけど（600 nmの波長の光の透過率＝O.D.600なんかで測ります）、O.D.600が0.4とか0.5とか……これはちょうど、最初透明だったLB培地が、薄いコンソメスープぐらいにまで濁ったぐらいですけど、そのぐらいになったら、満を持してIPTGをペッと加える感じですね。
pETシステムの場合、プラスミドにlacI遺伝子があり、しかも大腸菌BL21(DE3)のDE3の部分にもlacI（しかもこの記事で見ていた通り、lacIの強化版であるlacIq）が導入されていますから、色んな所から産み出されたlacIで、OFFスイッチはかなり強くしっかりと押されているといえますので、一般的に、結構高濃度のIPTGを入れないとスイッチがONにならないことが知られており、割と高い濃度、1 mMとか入れることが多いと思います（まぁ1 mMは大分濃いので、普通0.3 mMとかから始めるかと思いますが）。
もちろんIPTG添加タイミングや加えるIPTG濃度は実験による感じですし、そもそも「そんな具体的な数字いわれても、それが濃いかどうかなんて知らんがな(笑)」って感じかと思われますから、詳しい濃度の違いとかはともかくとしても、IPTGは大体1 Mという濃度のストック溶液を作るので、1/1000加えれば1 mMになりますから、1 Lの培地には、1 mL（もし500 mLを2本培養していたら、0.5 mL＝500 μLずつですね）のIPTGをピペットを使ってピュピュっと加えてやれば、それだけでスイッチONになるという、実に簡単なものだというお話でした。
なお、1 Lの大腸菌・OD=0.4とかは、まぁ結構ニオうっちゃニオうけどそこまで強いニオイではないものの、IPTGを加えて培養を続けると、激烈キングオブクサすぎてクサ物質へと変貌を遂げます(笑)。
ちなみに、どんなニオイかは、何せ大腸菌ですから、想像に難くないことでしょう。
っていうか糞便のニオイって硫黄系の化学物質がメインなのかなと思ってたんですが、改めて考えると、何で大腸菌自身がこんなニオイを発してるんですかね？
まぁ、先ほどの画像にある通り、IPTGには硫黄が含まれているのでそれも強烈なニオイの原因かなと思いますが（ちなみに、大腸菌に加える前のIPTGは、硫黄Sが含まれ分子なのに、無臭なんですけどね）、まぁでもIPTGなしでも、大量に菌が増えたら、例えばOD600が最終的には多分4とか5とか、下手したら10ぐらいにまで増えるかもしれませんが、増やし続けることで濃い～ぃ味噌汁以上に完全に濁りきったぐらいにまで生育しますけど、濃い大腸菌はIPTGなしでもあのニオイがしますしね、やっぱり大腸菌自体が悪臭の原因の最たるものということはできましょう。
…と、「そして翻訳へ…」と、ついにスイッチONでRNA→タンパク質ステップへと目を向ける予定でしたが、ニオイネタで結構長くなりましたし、そもそもそっちはついでで語るようなネタではなく、かなり大きなネタになりそうなので、続きはまた次回にさせていただこうかと思います。
とりあえず、散々引っ張ったスイッチONは、「IPTGという物質をペッと培養液に加えるだけ」という簡単なものだった感じですね（そして、悪臭増加スイッチのONでもある(笑)）。
RNAが合成されて、そこからのステップが果たしてどういうものか、簡単にまた追って見ていくといたしましょう。
